REKLAMA
REKLAMA

Bakteriofagi – strategia terapeutyczna w antybiotykoopornych zakażeniach bakteryjnych

Konsekwencją nadużywania i nieprawidłowego stosowania antybiotyków w medycynie, w weterynarii oraz w rolnictwie, jest szybkie rozprzestrzenianie się bakterii opornych na te leki, w tym szczepów wielolekoopornych, wśród których są szczepy niewrażliwe na żaden z dostępnych preparatów.

Wybór antybiotyku powinien opierać się na wynikach badań wrażliwości drobnoustrojów, po pobraniu materiału na posiew. Powszechnym błędem jest rutynowe podawanie antybiotyków o szerokim spektrum działania, bez identyfikacji czynnika etiologicznego zakażenia oraz stosowanie tej grupy produktów leczniczych do leczenia infekcji wirusowych. Ponadto przyjmowanie zbyt małych dawek czy przedwczesne przerywanie leczenia przez pacjentów, przyczynia się do rozwoju lekooporności bakterii na skutek powstawania mutacji genów bakteryjnych, a w konsekwencji do ich przenoszenia między bakteriami, nawet międzygatunkowo [8, 9, 15]. Niepokojące jest także tempo nabywania przez bakterie oporności na antybiotyki. Wiele opornych patogenów, takich jak MRSA (Staphylococcus aureus oporny na metycylinę), CRE (Enterobacteriaceae oporne na karbapenemy), VRE (Enterococcus oporne na wankomycynę) oraz Pseudomonas i Acinetobacter oporne na wiele leków antybakteryjnych, stały się poważnym zagrożeniem dla zdrowia [3]. Nadmierne i nieracjonalne stosowanie tetracyklin, jak również innych antybiotyków u zwierząt często prowadzi do występowania ich pozostałości w żywności i tym samym negatywnego wpływu na zdrowie ludzi. Pozostałości tetracyklin w żywności mogą powodować pojawianie się i rozprzestrzenianie na bardzo szeroką skalę opornych szczepów bakterii. Konsekwencją tego zjawiska mogą być niepowodzenia terapii antybiotykowej u ludzi. Okazuje się, że nawet małe dawki antybiotyku zawarte w żywności, a przyjmowane przez dłuższy czas mogą przyczyniać się do powstania lekoopornych szczepów bakteryjnych [20].

Antybiotykooporność rozumiana jako zdolność mikroorganizmu do adaptacji i wzrostu w obecności antybiotyku jest jednym z największych wyzwań współczesnej medycyny. Jest ona obserwowana we wszystkich rejonach świata. W wyniku infekcji lekoopornymi bakteriami na terenie Unii Europejskiej każdego roku umiera około 25 tysięcy osób [8, 38]. Leczenie zakażeń bakteriami opornymi na antybiotyki jest przyczyną wyższych kosztów opieki zdrowotnej. W samych Stanach Zjednoczonych generuje ono koszty opieki zdrowotnej rzędu 20 miliardów dolarów rocznie [1] (czytaj także: Terapeutyczne monitorowanie antybiotyków jako metoda poprawy skuteczności i bezpieczeństwa terapii).

Problem lekooporności bakterii związany jest nie tylko z pojawieniem się szczepów opornych, ale także z długim czasem niezbędnym do wytworzenia nowych antybiotyków w stosunku do szybkiego tempa rozwoju oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe [17]. Poszukiwania nowych środków przeciwinfekcyjnych przez firmy farmaceutyczne stają się coraz bardziej ograniczone, ze względu na rosnące koszty przeprowadzania odpowiednich badań, niskich zysków i wysokiego ryzyka inwestycji, właśnie z powodu możliwości szybkiego nabywania oporności na nowy lek [27].

REKLAMA
REKLAMA

Obecna sytuacja epidemiologiczna wymaga poszukiwania alternatywnych do antybiotykoterapii metod zwalczania zakażeń bakteryjnych [8, 9, 10, 15, 29] (czytaj także: Szpitalna lista antybiotyków — propozycja kierowana do szpitali).

Oporność bakterii na antybiotyki

Rozwój antybiotykooporności przewidział Aleksander Fleming, który podczas swojego wykładu noblowskiego mówił:

„… Mogą nadejść czasy, gdy penicylina będzie mogła być kupiona przez każdego […]. Istnieje więc niebezpieczeństwo, że nieświadomy […] człowiek będzie ją przyjmował w zbyt niskiej dawce i drobnoustroje poddawane nieodpowiednim dawkom leku staną się oporne. […]”.

Sam Fleming w trakcie pracy nad penicyliną zauważył, że kolejne pokolenia gronkowca złocistego, poddawanego działaniu penicyliny, wytwarzają ściany komórkowe coraz bardziej nieprzepuszczalne dla tego leku, odkrywając tym samym jeden z mechanizmów oporności na antybiotyki [7] (czytaj także: Problem antybiotykooporności w Polsce wg raportu NIK cz. I).

Mechanizmy powstawania oporności bakterii na leki

Mikroorganizmy wykazują dwa rodzaje oporności: wrodzoną oraz nabytą. Oporność wrodzona, charakterystyczna dla danego gatunku, może być związana z brakiem miejsca docelowego dla danego leku lub też posiadaniem struktur blokujących ich dostęp do wnętrza komórki. Nie jest wynikiem terapii i zwykle nie pociąga za sobą problemów medycznych. Oporność nabyta, charakterystyczna dla danego szczepu bakterii, ma miejsce w sytuacji kiedy genom podlega dziedzicznym, a tym samym trwałym zmianom. Mechanizm ten związany jest najczęściej z plazmidami oraz innymi ruchomymi elementami genetycznymi – transpozonami [8]. Oporność może być łatwo przekazywana między różnymi szczepami bakteryjnymi. Drobnoustroje potrzebują niekiedy tylko kilka miesięcy na wytworzenie nowego mechanizmu oporności, podczas gdy wprowadzenie na rynek nowego leku trwa wiele lat [15].

Przyjęto następujące definicje określające kategorie oporności na antybiotyki:

  • MDR – wielolekooporność (ang. multidrug-resistance). Termin MDR oznacza niewrażliwość na co najmniej jeden antybiotyk z trzech lub więcej grup leków przeciwbakteryjnych, mających zastosowanie w leczeniu zakażeń wywołanych przez dany gatunek drobnoustroju.
  • XDR – rozszerzona oporność (ang. extensively drug resistance). XDR oznacza, że drobnoustrój pozostaje wrażliwy tylko na antybiotyki z jednej lub dwóch grup leków, stosowanych w terapii zakażeń wywołanych przez ten drobnoustrój.
  • PDR – całkowita oporność (ang. pandrug-resistance). Drobnoustrój jest klasyfikowany jako PDR jeśli wykazuje niewrażliwość na wszystkie dostępne, antybiotyki, we wszystkich grupach stosowanych wobec danego gatunku drobnoustroju.

W kwalifikacji drobnoustroju do kategorii MDR, XDR lub PDR bierze się pod uwagę jedynie nabyte mechanizmy oporności drobnoustrojów, nie uwzględnia się natomiast leków, na które drobnoustrój wykazuje wrodzoną, naturalną, gatunkowo-specyficzną oporność [38].

Oto przykłady istotnych dla antybiotykoterapii mechanizmów lekooporności:

Hydroliza enzymatyczna cząsteczki antybiotyku przez enzymy (np. β-laktamazy) produkowane przez bakterie (Enterobacteriacae, Acinetobacter, Pseudomonas) – dotyczy to antybiotyków posiadających w swojej budowie wiązanie β-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy, monobaktamy).

Wypompowywanie antybiotyku z wnętrza komórki bakteryjnej. Istotą tego mechanizmu są białka transportowe występujące w strukturze błony komórkowej, które zmniejszają wewnętrzne stężenie antybiotyku. Pompy oporności wielolekowej (MDRs – z ang. multi drug resistance pumps) zdolne są do usuwania różnych antybiotyków, jak ma to miejsce w przypadku Pseudomonas aeruginosa, który posiada zdolność wypompowywania z komórki m.in. sulfonamidów, tetracyklin, β-laktamów, makrolidów oraz fluorochinolonów.

Zmiana ilości lub konformacji receptora (lub/i jego otoczenia) dla chemioterapeutyku np. metycylinooporne szczepy gronkowca złocistego (MRSA), a także gronkowca koagulazoujemnego (MRCNS).

Zmniejszenie zapotrzebowania na produkt szlaku metabolicznego, który podlega zahamowaniu lub wytworzenie szlaku alternatywnego [8, 9, 15].

Ograniczenie przepuszczalności błony komórkowej na skutek mutacji różnych białek błonowych. W wyniku tego zostaje zaburzony transport antybiotyków do wnętrza komórki. Zmiany obejmujące białko błonowe dotyczą głównie szczepów E. coli oraz P. aeruginosa. W rezultacie dochodzi do powstania oporności na aminoglikozydy, tetracykliny i chinolony [26].

 

Bakteriofagi – alternatywa dla antybiotyków

Znaczenie bakteriofagów w przyrodzie

Bakteriofagi (fagi, wirusy bakteryjne) to proste, ale niezwykle różnorodne, nieożywione byty biologiczne składające się z DNA lub RNA zamkniętego w kapsydzie białkowym [6]. Istnieją one w środowisku ziemskim od blisko 4 miliardów lat. Ocenia się, że całkowita populacja tych wirusów sięga wartości 1031 cząstek [13, 16]. Bakteriofagi stanowią naturalny czynnik regulujący liczebność populacji bakteryjnych w przyrodzie. Wykryto je wszędzie tam gdzie obecne są bakterie. Licznie występują zarówno w wodach słodkich jak i oceanach, a także w glebie. Mogą naturalnie występować w niektórych pokarmach i organizmie człowieka, np. w jelitach. Stanowią one najbardziej zróżnicowaną i prawdopodobnie najliczniejszą grupę wirusów [3, 8,  21, 39].

Odkrycie bakteriofagów

Odkrycie bakteriofagów było jednym z najbardziej doniosłych wydarzeń w mikrobiologii. Odkryli je prawie jednocześnie Frederick William Twort w Anglii (1915 r.) i Felix d’Herelle we Francji (1917 r.). Jednak po raz pierwszy ich aktywność lityczną zaobserwował brytyjski bakteriolog Ernst Hankin w 1896 roku [3]. Zauważył on przeciwbakteryjne właściwości wody z rzeki Ganges przeciw Vibrio cholerae. Spostrzegł że, Hindusi pijący wodę z Gangesu nie chorowali na cholerę [15].

U ludzi terapia bakteriofagami po raz pierwszy została zastosowana w 1921 roku w Belgii, przez prof. Richarda Bruynoghe’a w leczeniu gronkowcowych zakażeń skóry [19]. Jednocześnie na początku lat 20 XX wieku mikrobiolog Felix d’Herelle, podjął pierwsze próby leczenia czerwonki bakteryjnej z użyciem bakteriofagów, co zostało później wykorzystane, do leczenia tej choroby u żołnierzy w czasie II wojny światowej. W latach 30 XX wieku produkowano we Francji w laboratorium bakteriofagowym d’Herella preparaty fagowe aktywne wobec wielu typów bakterii. Wprowadzenie do lecznictwa antybiotyków spowodowało, że prace nad bakteriofagami zostały zahamowane, szczególnie w krajach Europy Zachodniej i Ameryki Północnej. Po 1990 roku, w związku z pojawieniem się licznych szczepów bakterii opornych na antybiotyki, zainteresowanie terapią fagową powróciło [15]. Dzięki opracowaniu narzędzi analitycznych zdolnych do badania tak małych cząstek jakimi są bakteriofagi (o dł. około 25-200 nm), czyli sekwencjonowanie nowej generacji oraz mikroskopia elektronowa, dziedzina biologii fagów, a w ślad za nią terapia fagowa mają możliwość szybkiego postępu [6].

Budowa i klasyfikacja bakteriofagów

Cząstka faga składa się z białkowego lub białkowo-lipidowego kapsydu otaczającego genom [3]. Białka są budulcem głównych komponentów strukturalnych cząstek fagowych, chronią fagowy kwas nukleinowy, uczestniczą w procesach adhezji do komórek bakteryjnych oraz mają aktywność enzymatyczną. Fagowe enzymy lityczne hydrolizują komponenty cukrowe oraz białkowe peptydoglikanu w ścianie komórkowej bakterii, działając zarówno od strony zewnętrznej, jak i wewnętrznej komórki gospodarza [21].

Ze względu na rodzaj materiału genetycznego występującego w kapsydzie, bakteriofagi można podzielić na cztery główne grupy: fagi z jednoniciowym DNA (ssDNA), dwuniciowym DNA (dsDNA), fagi z jednoniciowym RNA (ssRNA) i dwuniciowe fagi RNA (dsRNA) [3].

Wyróżniamy 13 rodzin bakteriofagów. Około 96% poznanych fagów to wirusy „ogonkowe” zbudowane z ikozahedralnej (dwudziestościennej) główki i ogonka. Wszystkie te bakteriofagi zawierają dwuniciowy DNA i zaliczane są do rzędu Caudovirales składającego się z 3 rodzin: Myoviridae (fagi posiadające kurczliwy ogonek) – ryc.1, Siphoviridae (fagi z długimi niekurczliwymi ogonkami) oraz Podoviridae (fagi z bardzo krótkimi ogonkami). Pozostałe 4% stanowią bakteriofagi należące do 10 innych rodzin i są to fagi o kształtach sześcianu, włókien lub pleomorficzne (różnokształtne) [22].

 

Ryc. 1. Schemat budowy bakteriofaga T4 z rodziny Myoviridae [23].

 Cykle życiowe bakteriofagów

Bakteriofagi inaczej „pożeracze bakterii” to wirusy zdolne do specyficznego infekowania komórek bakterii. Nie atakują one komórek eukariotycznych. Fagi lityczne prowadzą do lizy komórki bakteryjnej wkrótce po jej rozpoznaniu, natomiast fagi lizogeniczne (łagodne) wbudowują swój genom w postaci profaga do chromosomu bakteryjnego i pozostają uśpione, replikując się wraz z nim podczas każdego podziału komórki. Zmiana warunków środowiskowych może spowodować przejście w cykl lityczny, prowadząc do śmierci zainfekowanej komórki [8, 15, 24] – ryc. 2. Geny profagów mogą być korzystne dla gospodarza bakteryjnego i mogą kodować czynniki zjadliwości (np. toksynę błoniczą, toksynę Shiga i toksynę botulinową), geny metaboliczne i geny oporności na antybiotyki (np. Β-laktamazy) [6].

Ryc. 2. Cykl lityczny i lizogenny bakteriofaga – modyfikacja w oparciu o [37].

Możliwe są również inne losy bakteriofagów po wniknięciu do komórki bakteryjnej. Jedną z nich jest infekcja abortywna (zakażenie poronne), której konsekwencją jest śmierć komórki gospodarza bakteryjnego, bez jednoczesnej replikacji bakteriofaga. Innym możliwym cyklem bakteriofaga jest zakażenie chroniczne, kiedy gospodarz bakteryjny zachowuje zdolność wzrostu i podziałów pomimo replikacji oraz uwalniania bakteriofagów do środowiska. Pseudolizogenia ma miejsce, kiedy bakteriofag po zainfekowaniu komórki bakteryjnej nie replikuje się w niej i nie przechodzi w stan lizogenii. W przypadku restrykcji mimo wniknięcia genomu bakteriofaga do opornej komórki bakteryjnej, może dojść do zniszczenia wirusa i przeżycia komórki bakteryjnej. W mechanizm ten zaangażowany jest bakteryjny system restrykcji i modyfikacji [10]. Systemy restrykcji i modyfikacji kodują enzymy o aktywnościach metylotransferazy i endonukleazy restrykcyjnej. Oba enzymy danego systemu rozpoznają specyficznie te same sekwencje nukleotydowe. Metylotranseraza modyfikuje je, chroniąc tym samym przed działaniem endonukleaz restrykcyjnych [13]. Bakterie mogą wykryć i zniszczyć cząsteczki DNA należące do infekujących je wirusów za pomocą endonukleaz restrykcyjnych, które trawią obcy DNA, pozostawiając nietknięty ich własny, ulegający metylacji (przez metylotransferazę) w miejscach potencjalnego rozpoznawania przez te enzymy [30]. Nacięcie DNA w obrębie replikonów uniemożliwia ich replikację i utrzymanie w danym gospodarzu. Systemy restrykcji i modyfikacji ograniczają w ten sposób poziom infekcji fagowych [13].

Mechanizm działania bakteriofagów i jego wykorzystanie w terapii zakażeń bakteryjnych.

Głównym etapem w rozwoju wirusa jest odtworzenie jego informacji genetycznej, czyli zreplikowanie genomowego kwasu nukleinowego. Proces namnażania bakteriofagów obejmuje:

  • zdarzenia wczesne w tym przyłączanie się (adsorpcja) cząstek fagowych do powierzchni wrażliwych komórek i penetracja kwasu nukleinowego
  • zdarzenia biochemiczne – transkrypcja, translacja i replikacja wirusowego materiału genetycznego
  • składanie i dojrzewanie cząstek fagowych
  • wysiew cząstek wirusowych poza komórki gospodarza [13].

Pierwszym etapem infekcji fagowej jest proces adsorpcji bakteriofaga do komórki bakteryjnej. W procesie tym ważną rolę odgrywa płytka podstawowa, z którą związane są enzymy lityczne oraz włókienka bakteriofaga rozpoznające specyficzne receptory na powierzchni komórki bakteryjnej. Receptorami tymi są struktury powierzchniowe bakterii takie jak lipopolisacharydy, kwasy tejchojowe, białka, a nawet pilusy (rodzaj pustego w środku włoska komórkowego, przez który może wnikać materiał genetyczny) i wici bakterii. U bakterii Gram-ujemnych częstym receptorem są główne i boczne łańcuchy lipopolisacharydów i białka błonowe (np. kanały transportowe). U bakterii Gram-dodatnich najczęstszym receptorem są łańcuchy peptydoglikanu i kwasy tejchojowe (np. PGP (poli-[fosforan glicerolu]) i GTA (poli-[fosforan glukozo-N-acetylogalaktozaminy]). W kolejnym etapie do wnętrza komórki bakteryjnej wprowadzany jest fagowy materiał genetyczny poprzez ogonek bakteriofaga. Po wstrzyknięciu materiału genetycznego do wnętrza bakterii pozostałe elementy faga (białka kapsydu) zostają na zewnątrz komórki gospodarza [5]. Następnie bakteriofagi wbudowują własne geny w genom bakterii w taki sposób, że bakteria zaczyna produkować kopie fagów. Po namnożeniu się faga dochodzi do lizy komórki i uwolnienia nowopowstałych cząstek fagowych. W procesie lizy komórkowej również uczestniczą specjalne enzymy, degradujące błonę komórkową od wewnątrz [15, 21]. Komórka ulegając lizie, uwalnia około 100 bakteriofagów. Całkowity cykl lityczny, od adsorpcji do uwolnienia, trwa około 30 minut [31].

Opisany powyżej mechanizm działania jest całkowicie odmienny od mechanizmu działania antybiotyków, dzięki czemu bakteriofagi mogą być skuteczne w bardzo specyficznym leczeniu infekcji bakteryjnych, stanowiąc swoistą alternatywę dla antybiotyków oraz mogą być stosowane do leczenia zakażeń antybiotykoopornymi szczepami bakterii [15, 21].

Właściwości bakteriofagów istotne w terapii zakażeń.

Zdolność bakteriofagów do zabijania bakterii pozwala na ich wykorzystanie jako środki przeciwbakteryjne. Dokonując wyboru fagów należy kierować się ich skutecznością w dziesiątkowaniu populacji docelowych bakterii oraz brakiem zdolności kodowania bakteryjnych czynników wirulencji. Niektóre niepowodzenia terapii fagowej mogą wynikać z niedostatecznego dostarczenia fagów do miejsca zakażenia, podobnie jak niedostateczne stężenie leku może spowodować niepowodzenie leczenia. Zapewnienie wystarczającej liczby fagów w pożądanym miejscu, w celu osiągnięcia skuteczności terapii fagowej, jest zadaniem ułatwionym przez względny brak toksyczności fagów w stosunku do pacjenta [25].

Niezwykle istotną cechą fagów jest ich specyficzność względem gospodarza związana z obecnością odpowiedniego receptora na powierzchni komórki bakteryjnej [16].  Niektóre z fagów są specyficzne dla szczepu, podczas gdy inne mają zdolność infekcji szeregu szczepów bakteryjnych,  a nawet ich rodzajów. Bakterie rozwinęły wiele mechanizmów odporności na infekcje przez fagi lityczne, a fagi mają równie imponującą różnorodność mechanizmów przełamywania tej odporności [6].

Bardzo skomplikowana, ze względu na zdolność do samoreplikacji, okazuje się farmakokinetyka fagów. Trudno zbudować precyzyjny matematyczny model wyjaśniający oddziaływanie pomiędzy fagiem a komórką gospodarza [22]. Bakteriofagi są łatwo wchłaniane przez błony śluzowe człowieka. Po doustnym stosowaniu bakteriofagi mogą swobodnie przedostać się do krwi i innych tkanek. Po podaniu analnym wchłanianie do krwi może być tak wysokie, jakie obserwuje się po podaniu domięśniowym. Fagi znajdujące się w krwiobiegu z łatwością penetrują do zainfekowanych tkanek. Zdolne są także do pokonywania bariery krew – mózg. Ich transport może dokonywać się również za pomocą układu limfatycznego. Fagi usuwane są z krążenia przez układ siateczkowo-śródbłonkowy  [8, 25]. Rozpad fagów w organizmie, tj. ich inaktywacja lub wydalanie mają wpływ na skuteczność terapii fagowej, gdyż bezpośrednio wpływają na potencjał wzrostu i utrzymania populacji faga [25].

W leczeniu wykorzystuje się bakteriofagi lityczne, które mają zdolność do namnażania się w bakterii patogennej i do jej lizy  [13].

Enzymy lityczne

Bakteriofagi mają zdolność kodowania enzymów litycznych zwanych hydrolazami peptydoglikanu, które są używane do infekowania i/lub uwalniania wirionów potomnych z bakteryjnej komórki gospodarza. Hydrolazy peptydoglikanu związane z cząsteczkami faga (lizyny płytki podstawowej bakteriofagów) miejscowo nadtrawiają peptydoglikan powodując degradację ściany komórkowej bakterii i tym samym umożliwiając zakażenie komórki gospodarza. Jest to tak zwana „liza z zewnątrz” [3, 14].

Ryc. 3. Schemat działania systemu holina – endolizyna [14].

Większe bakteriofagi, o genomie w postaci dwuniciowego DNA, w końcowym etapie cyklu litycznego kodują co najmniej dwa białka lityczne konieczne do wywołania lizy komórki bakteryjnej: holinę (od hole – dziura, białko które akumuluje się w błonie cytoplazmatycznej bakterii) i endolizynę (hydrolazę peptydoglikanu, białko o aktywności muralitycznej). Holina w ściśle zaprogramowanym czasie powoduje powstawanie letalnych uszkodzeń lub „dziur” w błonie komórkowej bakterii, prowadząc do zwiększenia jej przepuszczalności. Proces ten umożliwia endolizynie przedostanie się z cytoplazmy do peryplazmy komórki bakteryjnej i uszkodzenie peptydoglikanu ściany komórkowej, czego rezultatem jest liza wewnątrz bakterii i uwolnienie nowego pokolenia fagów – Ryc. 3.

U większości fagów funkcje endolizyn i lizyn płytki podstawowej pełnią różne białka. Znane są jednak bakteriofagi, np. gronkowcowy fag MR11, w przypadku których funkcje endolizyny i enzymu litycznego płytki podstawowej pełni jedno białko [14].

Egzogenne działanie endolizyny fagowej na bakterie można wykorzystać do wywołania lizy z zewnątrz, z powodu wysokiego ciśnienia osmotycznego w komórce. Jest to punkt wyjścia do badań nad zastosowaniem oczyszczonych endolizyn fagowych jako środków przeciwdrobnoustrojowych aktywnych przeciwko patogenom Gram-dodatnim. W przypadku bakterii Gram-ujemnych, ze względu na obecność nieprzepuszczalnej błony zewnętrznej, zwykle konieczne jest zastosowanie środka powierzchniowo czynnego lub innego dodatkowego mechanizmu, który umożliwia przemieszczenie endolizyny przez błonę zewnętrzną [3]. Każdy fag może kodować kilka unikatowych enzymów lizyny i holiny, z których niektóre są wysoce specyficzne, ale inne mogą wykazywać aktywność w szerokim spektrum między szczepami, a nawet między gatunkami bakterii. Lizyny działają szybko, silnie i są nieaktywne wobec komórek eukariotycznych. Łączenie lizyny fagowej i antybiotyków może być bardziej skuteczne w eliminowaniu infekcji, niż w przypadku stosowania samych antybiotyków. Uważa się za mało prawdopodobne, aby bakterie ewoluowały oporność na lizyny ze względu na fakt, że atakują one miejsca na ścianie komórkowej peptydoglikanu o kluczowym znaczeniu dla żywotności bakterii [6].

Terapia fagowa w praktyce

Dostępne w literaturze badania wskazują na ogromny potencjał leczenia przy zastosowaniu bakteriofagów. Cytowane poniżej prace, dostarczają cennej praktycznej wiedzy na temat terapii bakteriofagami.

Polskie doświadczenia w terapii fagowej

Leczenie fagami przeprowadzono na 10 oddziałach klinicznych i szpitalnych, we Wrocławiu, Lublinie, Oleśnicy oraz w Kamiennej Górze, w sumie u 138 pacjentów. 78 % pacjentów poddanych fagoterapii to osoby w wieku 21–77 lat, a stosunek mężczyzn do kobiet był prawie równy. Choroby w których zastosowano terapię z użyciem fagów pogrupowano w następujący sposób: choroby zakaźne, zaburzenia immunologiczne (humoralne, komórkowe), choroby układu krążenia (owrzodzenie kończyn dolnych), choroby układu oddechowego (zapalenie śluzowo-ropne dróg oddechowych, zapalenie płuc, zapalenie oskrzeli, ropne zapalenie osierdzia górnego, zapalenie śródpiersia), choroby układu pokarmowego (choroby jamy ustnej, ropne zapalenie otrzewnej), choroby układu moczowo-płciowego (kłębuszkowe zapalenie nerek, infekcje dróg moczowych) choroby skóry i tkanki podskórnej (czyrak mnogi, ropnie skórne, odleżyny), choroby układu mięśniowo-szkieletowego i tkanki łącznej (ropne zapalenie stawów, zakaźne zapalenie mięśni, pooperacyjne zapalenie stawów), urazy (stłuczenia, rany pooperacyjne, oparzenia, rany otwarte, infekcje ropne po złamaniu kości). Spośród 138 badanych przypadków potwierdzono 90 monoinfekcji i 48 poliinfekcji. Przyczyną infekcji były następujące patogeny: Staphylococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris. Sporadycznie izolowano inne mikroorganizmy.

Podczas terapii wykorzystano lizaty zjadliwych bakteriofagów, które powodowały całkowitą lizę wrażliwych szczepów bakteryjnych izolowanych od pacjentów. Bakteriofagi podawano doustnie 3 razy dziennie, w ilości jednej ampułki o pojemności 10 ml, 30 minut przed posiłkiem, po zobojętnieniu soku żołądkowego, stosując np. sodę oczyszczona lub szklankę wody Vichy. W przypadku zastosowania fagów bezpośrednio na ranę – podawano je jako przymoczki 3 razy na dobę. Bakteriofagów nie podawano dożylnie z obawy przed możliwymi wstrząsami. W trakcie leczenia prowadzono regularną kontrolę bakteriologiczną i ocenę wrażliwości izolowanych bakterii na stosowane bakteriofagi. W razie potrzeby bakteriofag był zmieniany. W przypadku braku bakterii w posiewie bakteriofagi były nadal stosowane profilaktycznie przez 14 dni.

Na uwagę zasługuje fakt, że w 125 przypadkach (90,6%) spośród 138 leczonych, fagoterapię przeprowadzono u pacjentów opornych na antybiotyki i chemioterapeutyki, jako jedyny sposób hamowania i kontroli zakażenia. Pozostałych 13 pacjentów (9,4%) nie było uprzednio leczonych antybiotykami, a fagoterapię zastosowano jako leczenie pierwszego rzutu.

Wyniki terapii fagowej oceniono według czterostopniowej skali: + + + + doskonały efekt przejawiający się całkowitym wyzdrowieniem (16,10%), + + + znaczący efekt przejawiający się całkowitym wygojeniem miejscowych zmian i likwidacją ropnego procesu (71,70%), + + znacząca poprawa stanu miejscowego z tendencją do gojenia się zmian i negatywny wynik kultury bakteriologicznej (5,70%), + przejściowa poprawa stanu miejscowego (6,50%).

W przeprowadzonym badaniu dokonano następujących obserwacji:

  1. Spośród 138 przypadków leczonych bakteriofagami u 129 (93,5%) uzyskano dobry wynik terapeutyczny objawiający się kontrolą zakażenia i gojeniem miejscowych zmian chorobowych.
  2. Efekt terapii fagowej jest związany z wiekiem pacjentów, którzy zostali jej poddali. W grupie +, ++ byli pacjenci ze średnią wieku 41,6, natomiast w grupie +++, ++++ średnia wieku wyniosła 32,2.
  3. Nie stwierdzono zależności między płcią pacjentów a efektem terapii fagowej.
  4. Uzyskane wyniki nie potwierdziły różnic w działaniu terapii fagowej w mono- i poliinfekcjach.
  5. Porównano wpływ terapii fagowej w mono- i poliinfekcjach dla czterech bakterii: Staphylococcus, Klebsiella, Escherichia, Pseudomonas. Dla wszystkich powyższych organizmów nie zaobserwowano zależności między rodzajem zakażenia a wynikiem leczenia.
  6. Nie stwierdzono istotnej zależności między wynikiem leczenia a stanem pacjenta na początku terapii fagowej.
  7. Terapię fagową przeprowadzono u 125 pacjentów (90,6%), u których leczenie antybiotykami okazało się nieskuteczne, a bakterie wykazywały oporność na większość zastosowanych antybiotyków. Grupę oporną na antybiotyki porównano z małą grupą pacjentów, nieleczoną antybiotykami obejmującą 13 osób (9,4%). Wynik leczenia nie ma istotnego związku z tym, czy zastosowano uprzednio leczenie antybiotykiem, które okazało się nieskuteczne czy też nie podawano antybiotyków przed terapią fagową.
  8. Lokalne nałożenie faga bezpośrednio na ranę lub na przetoki spowodowało oczyszczenie rany w 3-4 dniu, a także wyjątkowo szybką granulację.
  9. Działania niepożądane w trakcie przeprowadzonej terapii fagowej były bardzo rzadkie. Spośród 138 leczonych pacjentów odnotowano tylko 3 przypadki ze skutkami ubocznymi, z których 2 wykazywały nietolerancję preparatu fagowego po podaniu doustnym i 1 objawy alergiczne przy miejscowym zastosowaniu na ranę. Dokonano ponadto następujących obserwacji: przeważnie w 3-5 dniu terapii fagowej wystąpiła hepatalgia (ból odczuwalny w okolicy wątroby) [36]), która trwała kilka godzin. Można to tłumaczyć masowym uwalnianiem endotoksyn w wyniku działania fagów na bakterie. W ciężkich przypadkach ze zdiagnozowaną posocznicą po nieudanej terapii antybiotykowej, wzrost temperatury wystąpił w 7-8 dniu podawania faga, co trwało 24 godziny. Dlatego do 8 dnia leczenia bakteriofagami zaleca się uważnie obserwować pacjentów. Ogólnie, w 7 dniu obserwowano wyraźną poprawę ogólnego samopoczucia pacjentów, bóle ustępowały, a temperatura i OB spadały [32].

Zastosowanie terapii fagowej u pracownika służby zdrowia będącego nosicielem MRSA

U 30-letniej pielęgniarki rozpoznano początkowo infekcję dróg moczowych wywołaną MRSA. Pielęgniarka była leczona antybiotykiem dobranym na podstawie badania wrażliwości szczepu. Odnotowano poprawę kliniczną. Przeprowadzono następnie badania mające na celu zidentyfikowanie źródła infekcji. Próbki pobrane z nozdrzy i gardła były ujemne pod kątem szczepu MRSA, natomiast wymaz z odbytu był pozytywny. Wykluczono kolonizację nosa i gardła, dlatego przewód pokarmowy uznano za źródło kolonizacji dla układu moczowo-płciowego. Pielęgniarka odmówiła dekolonizacji antybiotykami, ale zgodziła się na leczenie fagami.

W terapii zastosowano preparat zawierający trzy fagi i powodujący całkowitą lizę szczepu MRSA. Podawano go doustnie trzy razy dziennie. Postęp dekolonizacji szczepu MRSA sprawdzono mikrobiologicznie. Badanie przesiewowe ujawniło tylko pojedyncze kolonie MRSA w pierwszym tygodniu leczenia fagów, po czym wymazy z odbytu stały się ujemne. Dekolonizacja została potwierdzona przez negatywne wyniki hodowli z wymazu z nosa, gardła, odbytu, kału i pochwy po zakończeniu terapii. Wymazy z odbytu pobrane w miesięcznych odstępach w ciągu następnego półrocza były ujemne. Nie odnotowano żadnych skutków ubocznych terapii fagowej ani żadnych istotnych zmian parametrów laboratoryjnych [28].

Zastosowanie terapii fagowej u pacjentów z opornym przewlekłym zapaleniem błony śluzowej nosa i zatok spowodowanych zakażeniem Staphylococcus aureus

Badanie przeprowadzono w celu ustalenia bezpieczeństwa, tolerancji i skuteczności koktajlu fagowego AB-SA01 u pacjentów z opornym przewlekłym zapaleniem błony śluzowej nosa i zatok spowodowanych Staphylococcus aureus. Trzy grupy pacjentów (3 pacjentów/grupę) otrzymywały dwa razy dziennie seryjne dawki irygacji donosowych z koktajlu fagowego AB-SA01 w stężeniu: 3 × 108 PFU przez 7 dni (grupa 1), 3 × 108 PFU przez 14 dni (grupa 2), 3 × 109 PFU przez 14 dni (grupa 3). Wszystkich 9 uczestników (4 mężczyzn i 5 kobiet; średnia wieku, 45 lat) ukończyło badanie. Donosowe leczenie fagami było przez nich dobrze tolerowane. Nie odnotowano poważnych zdarzeń niepożądanych ani zgonów w żadnej z 3 grup. Nie wystąpiła żadna zmiana parametrów życiowych. Nie stwierdzono zmian w biochemii, z wyjątkiem 1 uczestnika w grupie 3, który wykazał spadek poziomu wodorowęglanu we krwi podczas wizyty przy wypisie po zakończeniu terapii, przy normalnych wynikach badania fizykalnego i parametrów życiowych. Nie zanotowano żadnych zmian temperatury przed, podczas lub po leczeniu. Sześć działań niepożądanych zgłoszono u sześciu uczestników; wszystkie zostały sklasyfikowane jako łagodne skutki uboczne pojawiające się podczas leczenia i ustąpiły do ​​końca badania. Wstępne badania skuteczności wskazały na pozytywne wyniki we wszystkich grupach. U dwóch z dziewięciu pacjentów wykazano kliniczne i mikrobiologiczne dowody wyeliminowania infekcji. Irygacja donosowa koktajlem fagowym AB-SA01 jest bezpieczna i dobrze tolerowana przy najwyższej badanej dawce (3 × 109 PFU przez 14 dni) z obiecującymi wstępnymi wynikami skuteczności i mogła by być potencjalną alternatywą dla antybiotyków u pacjentów z przewlekłym zapaleniem błony śluzowej nosa i zatok z powodu Staphylococcus aureus [2].

 

Badania in vitro i in vivo skuteczności i bezpieczeństwa koktajlu fagowego oraz endolizyny przeciw wysoce opornej na wiele leków Acinetobacter baumannii przeprowadzone w College of Medicine, Uniwersytet Al-Nahrain, Bagdad, Irak.

Acinetobacter baumannii jest Gram-ujemnym, oportunistycznym patogenem, który z łatwością rozprzestrzenia się na oddziałach intensywnej terapii. Większość izolatów klinicznych A. baumannii to bakterie oporne na dostępne leczenie.

W przedmiotowym badaniu próbki bakteryjne pochodziły z dwudziestu trzech izolatów A. baumannii (11 XDR, 12 PDR), pobranych od hospitalizowanych pacjentów z różnymi infekcjami, w tym z posocznicą, infekcją skóry, ciężkim zakażeniem układu moczowego, zapaleniem płuc i zapaleniem opon mózgowych. Próbki do izolacji fagów pozyskano z różnych regionów miasta Bagdad, w tym ścieków, gleby rolniczej, odchodów owiec, ściółki drobiowej oraz szpitali. Wyizolowano 136 litycznych fagów specyficznych dla A. baumannii, z których większość była wysoce lityczna i powodowała zahamowanie wzrostu bakterii w badaniach in vitro. Przedmiotem badan była również wyodrębniona z wysoce litycznych fagów endolizyna fagowa.

Wyizolowane bakteriofagi posłużyły do produkcji terapeutycznego koktajlu fagowego utworzonego przez zmieszanie 64 fagów specyficznych dla 23 izolatów A. baumannii (AB1-AB23). Wszystkie izolaty bakteryjne, z wyjątkiem AB2 i AB8, były celem więcej niż jednego faga. W przypadku izolatu AB3, 6 różnych fagów miało tę samą specyfikę w kierunku tego izolatu.

Aż 18 na 23 izolatów (78,3%) bakterii A. baumannii było całkowicie wrażliwych na stosowane fagi lityczne. Tylko w przypadku 5 z 23 (21,7%) izolatów A. baumannii rozwinął się pewien poziom opornych kolonii w miejscu zastosowania litycznego faga. Utworzony koktajl fagowy zminimalizował liczbę opornych kolonii bakteryjnych, które pojawiały się przy pojedynczych fagach. Wyniki badania wykazały, że gdy izolat A. baumannii rozwija oporność na jednego faga w koktajlu fagowym, jest on nadal wrażliwy na inne fagi w tym samym koktajlu fagowym. Stosowanie koktajli fagowych zapobiega pojawieniu się mutantów odpornych na fagi.

Eksperyment in vivo przeprowadzony na myszach zainfekowanych wysoce opornym A. baumannii wykazał że, terapia fagowa z powodzeniem wyleczyła i pozwoliła na przeżycie wszystkich myszy zakażonych A. baumannii w przeciwieństwie do grupy nieleczonej, która nie przeżyła.

Wykazano również silne działanie przeciwbakteryjne endolizyny, w krótkim czasie po podaniu. Gęstość i żywotność A. baumannii zmniejszyła się po jednej godzinie leczenia w porównaniu z grupą kontrolną nietraktowaną endolizyną fagową, która nadal rosła po tym czasie. Endolizyny fagowe są postrzegane jako nowa droga do leczenia lekoopornych zakażeń bakteryjnych z powodu ich szybkiego działania, niskich dowodów rozwoju oporności oraz niskiej cytotoksyczności wobec komórek ssaków. Ponadto terapia fagowa okazała się bezpieczna. Podawana była myszom ogólnoustrojowo bez żadnych skutków ubocznych [4].

Bezpieczeństwo stosowania bakteriofagów

Najważniejszym aspektem fagów jako środków przeciwbakteryjnych, oprócz ich zdolności do zabijania bakterii, jest ich niska toksyczność. Ta niska toksyczność jest konsekwencją składu fagów, który dla większości z nich jest prawie całkowicie białkiem i DNA. Organizm ludzki, z którym fagi wchodzą w interakcję może łatwo doprowadzić do degradacji wirionów fagowych w drodze metabolizmu. Jednak, w przeciwieństwie do rozkładu metabolicznego niektórych leków, degradacja fagów nie powoduje produkcji toksycznych produktów ubocznych. Nie mniej jednak należy mieć na względzie anafilaktyczne odpowiedzi układu odpornościowego na białka związane z wirionami fagowymi. Reakcje te są stosunkowo rzadkie, a także łagodne, jeśli już do nich dochodzi. Fagi można również wybierać i oczyszczać w taki sposób, aby były minimalnie związane z czynnikami wirulencji, takimi jak endotoksyny lub geny kodujące egzotoksyny. Stosowanie fagów może być niebezpieczne w sytuacjach nadmiernej lizy bakteryjnej i uwalniania toksyn bakteryjnych, jak np. w przypadku ciężkich  infekcji bakteryjnych, potencjalnie prowadzących do sepsy [25].

Bezpieczeństwo fagoterapii jest obserwowane podczas jej praktycznego zastosowania u pacjentów, którzy jeśli doświadczają działań niepożądanych są one zwykle łagodne [2, 28, 32].

Zalety terapii fagowej

Bakteriofagi wykazują specyficzność zarówno w stosunku do wielu bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych [9]. Zakłada się że podanie pacjentowi odpowiednio dobranego bakteriofaga rozpocznie proces jego namnażania, uwalniania potomnych wirionów atakujących kolejne komórki bakteryjne, aż do likwidacji całej populacji patogenu [13].

Szybka dystrybucja fagów w organizmie pozwala dotrzeć do narządów (np. gruczołu krokowego, kości i mózgu), które nie są łatwo dostępne dla leków [1]. Bakteriofagi powielają się w miejscu zakażenia, a zatem są dostępne tam, gdzie są najbardziej potrzebne [29]. Gdy organizm docelowy nie jest obecny, fagi nie będą się replikować [1]. Terapia fagowa charakteryzuje się unikatową cechą samoistnego zwiększania dawki „leku” podczas trwania infekcji. Po zabiciu wszystkich bakterii patogennych fagi zostają usunięte z organizmu, gdyż nie są w stanie rozwijać się w komórkach eukariotycznych. Bakteriofagi mogą być stosowane przy małej dawce rzędu 103 cząsteczek/ml [13].

Oporność bakteryjna na fagi wydaje się być niższa w porównaniu do oporności wywołanej przez antybiotyki. Bardzo wysoka specyficzność bakteriofagów w stosunku do gospodarza – bakterii, ograniczona do określonego gatunku, a nawet szczepu pozwala uniknąć zaburzenia pracy mikroflory jelit, co stanowi poważny efekt uboczny w przypadku antybiotykoterapii [8, 9].             Terapia fagowa jest zasadniczo wolna od skutków ubocznych [1]. Nie bez znaczenia jest fakt iż, produkcja preparatów fagowych jest stosunkowo tania [24].

Ograniczenia związane ze stosowaniem bakteriofagów

Jedną z wad stosowania fagów w medycynie jest fakt, że nie wszystkie fagi dają dobre wyniki terapeutyczne. Ponadto fagi lizogenne są powszechnie uważane za nieodpowiednie do leczenia z powodu ich wysokiego prawdopodobieństwa poziomego transferu genów. Zdolność integracji DNA niesie bowiem ze sobą możliwość przeniesienia z jednej bakteryjnej komórki do drugiej, informacji genetycznej kodującej czynniki wirulencji, antybiotykooporności, a także toksyny. Postuluje się jedynie w pełni zsekwencjonowane bakteriofagi do leczenia. Całkowite sekwencjonowanie (odczytanie kolejności nukleotydów w genomie w celu poznawania struktury i funkcji genów [35]) pozwala uniknąć stosowania fagów zawierających „toksyczne” geny lub czynniki wirulencji [8, 17, 22].  Kolejną wadą fagoterapii jest uwalnianie endotoksyn bakteryjnych, w czasie gdy komórki bakteryjne ulegają lizie w wyniku infekcji fagowej [13]. Niepożądane jest również powstawanie mutantów bakteryjnych opornych na wybrany typ bakteriofaga. Komórki bakteryjne mogą ewoluować mechanizmy odporności na fagi (np. poprzez modyfikację receptorów fagowych na powierzchni bakteryjnej). Statystycznie, we wszystkich populacjach bakteryjnych, takie oporne mutanty istnieją i stają się powszechne z powodu selektywnej presji bakteriofagów podczas terapii fagowej. Aby temu przeciwdziałać, podaje się często mieszaninę kilku bakteriofagów litycznych w stosunku do bakterii [13, 17]. Kluczową kwestią w skuteczności fagów jest ich neutralizacja przez układ odpornościowy gospodarza. Bakteriofagi są z organizmu dość szybko usuwane i często efektywność ich stosowania jest mniejsza od spodziewanej. Poprzez odpowiedź immunologiczną organizm może zmniejszać skuteczność terapii fagowej [3, 13, 17, 24]. Dodatkowo, reakcja alergiczna może zawęzić zakres możliwego zastosowania bakteriofagów [17]. Celując w pojedynczy patogen, terapia fagowa może być mniej skuteczna przeciwko infekcjom takim jak zakażone rany po oparzeniu, które często są kolonizowane przez więcej niż jeden szczep bakterii [6]. Ponadto wąskie spektrum aktywności bakteriofagów, niewątpliwie korzystne terapeutycznie, skutkuje koniecznością szybkiej i dokładnej identyfikacji patogenu, szczególnie w aspekcie jego fagowrażliwości. Rozwiązaniem jest stosowanie mieszanek fagów, działających na wiele gatunków bakterii. Jednak wtedy taka terapia zostaje częściowo pozbawiona korzyści wąskiego spektrum działania [24].

Brak stabilności niektórych wirusów w otaczającym je środowisku jest czynnikiem ograniczającym podczas wytwarzania preparatów fagowych i dalszego ich przechowywania.  Wykazano, że bakteriofagi są wrażliwe na niskie pH, wysoką temperaturę, zasolenie, ciśnienie osmotyczne oraz rozpuszczalniki organiczne a także na małą wilgotność środowiska [11]. zamrażanie, wysokie temperatury lub długie przechowywanie w warunkach chłodniczych może spowodować degradację faga [17]. Przeprowadzono badanie [33] porównania skuteczności różnych metod konserwowania bakteriofagów celem ich długotrwałego przechowywania. Próbki różnorodnych bakteriofagów przechowywano przez 2 lata w temperaturze 24-28 ° C oraz 4 ° C w bulionie, w 50% glicerolu, suszono i liofilizowano.  Miana bakteriofagów określone po ich obróbce wskazywały, że spośród metod bulionu, glicerolu i liofilizacji, liofilizacja była najbardziej szkodliwa dla badanych fagów, glicerol mniej, a metoda bulionowa najmniej szkodliwa. Po 2 latach miana nasyconych roztworów bulionowych były na ogół wyższe niż glicerolu lub preparatów liofilizowanych. Suszone preparaty generalnie nie okazały się zadowalające. Preparaty przechowywane w 4 ° C wykazywały wyższe miana fagów niż te przechowywane w temperaturze pokojowej. Wszystkie miana spadały z czasem, niezależnie od metod konserwacji.

Powyższe ograniczenia należy wziąć pod uwagę przy rozważaniu terapii fagowej. Pomimo tych niepożądanych właściwości, zastosowanie fagów do leczenia zakażeń, szczególnie opornymi na antybiotyki bakteriami jest nadal bardzo obiecującą alternatywną, mogącą być jedyną dostępna opcją ratowania  życia pacjentów [1].

Leczenie bakteriofagami w Polsce

Pierwszy Ośrodek Terapii Fagowej na terenie Unii Europejskiej powstał w 2005 r. przy Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod kierunkiem prof. Andrzeja Górskiego. Posiada on ponad 500 wirulentnych fagów różnego pochodzenia. Ośrodek ten prowadzi eksperymentalne leczenie chorych zakażonych antybiotykoopornymi bakteriami [1, 16]. Jego zadaniem jest kwalifikacja pacjentów do eksperymentalnej terapii fagowej i jej prowadzenie zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez komisję bioetyczną oraz monitorowanie stanu pacjentów po zakończeniu terapii. Niedawno otwarte zostały jego filie w Krakowie i Częstochowie. Od 2016 r. do leczenia w ośrodku kwalifikowani są nie tylko dorośli ale również dzieci od 6 roku życia. Terapia fagowa prowadzona jest w Ośrodku Terapii Fagowej i jego filiach na zasadzie eksperymentu leczniczego. Nie jest ona badaniem klinicznym. Dlatego też koszty związane z tym leczeniem nie są refundowane lecz pokrywane przez pacjentów. Pacjent, który ma zostać zakwalifikowany musi podpisać formularz świadomej zgody na leczenie eksperymentalne, w którym szczegółowo opisano zasady oraz ryzyko związane z prowadzonym leczeniem.  Wskazania do terapii fagowej obejmują objawowe zakażenia bakteryjne skóry lub tkanki podskórnej, kości i szpiku, stawów, przetok ran i odleżyn, dróg moczowych, dróg rodnych, prostaty, przewodu pokarmowego, ucha środkowego, zatok, migdałków, górnych lub dolnych dróg oddechowych. Leczenie jest stosowane w przypadkach, w których stosowanie antybiotyku było nieskuteczne lub jest ono przeciwwskazane i wyczerpano wszystkie możliwe standardowe sposoby leczenia infekcji. Leczenie odbywa się w trybie ambulatoryjnym. Średni czas terapii wynosi 6-8 tygodni. Preparaty fagowe maja postać płynu i mogą być stosowane doustnie, doodbytniczo lub miejscowo w postaci przymoczek, kompresów nasączonych preparatem, kropli do nosa i ucha, aerozolu do inhalacji, wlewek doodbytniczych oraz do płukania gardła, pochwy, przetok i jam ropni. Wytwarzane preparaty fagowe mogą być stosowane u chorych z zakażeniami wywołanymi przez bakterie z rodzaju: Staphylococcus, Enterococcus, Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus, Acinetobacter, Citrobacter, Enterobacter, Stenotrophomonas, Shiegella, Salmonella, Burkholderia, Morganella. Nie wszystkie szczepy bakteryjne należące do wyżej wymienionych rodzajów są wrażliwe na fagi z kolekcji Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN [39] (czytaj także: Przeszczep mikrobioty jelitowej jako obiecująca alternatywa farmakoterapii zakażeń Clostridioides difficile).

Ważne ośrodki fagoterapii na świecie

Jednym z największych ośrodków na świecie prowadzącym badania nad preparatami fagowymi jest od 1923 roku Instytut im. Eliava w Tbilisi, działający przy Instytucie Mikrobiologii i Wirusologii w Gruzji. Ośrodek ten posiada ogromną kolekcją bakteriofagów i jest obecnie zaangażowany w produkcję nowoczesnych preparatów bakteriofagowych [10]. Do ważniejszych ośrodków na świecie prowadzących badania nad bakteriofagami należy zaliczyć: Novolytics w Wielkiej Brytanii, Biophage Pharma w Kanadzie, Gangagen w Kanadzie, Kalifornii oraz Indiach, Omnilytics w USA, Phage Biotech w Izraelu, Phico Therapeutics w Wielkiej Brytanii [15].

Źródła pozyskiwania fagów do terapii.

Fagi występują wszędzie tam, gdzie są obecne bakterie, na których one żerują a więc: w  morzach, w ziemi, w ściekach, na skórze, w układzie pokarmowym zwierząt i ludzi, w pokarmach. Najczęściej pozyskuje się fagi terapeutyczne ze ścieków, często szpitalnych. Na potrzeby laboratorium Ośrodka Terapii Fagowej Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN bakteriofagi otrzymywane są z wrocławskich ścieków, ale także z egzotycznych miejsc, np. z wody z rzeki Kwai i z innych obszarów Azji. Materiał, w którym spodziewamy się znaleźć fagi, wysiewa się na płytkę z bakteriami. Po inkubacji powstają na niej łysinki czyli miejsca, gdzie fagi spowodowały lizę bakterii. Zawartość łysinek namnaża się następnie na konkretnych szczepach bakteryjnych, otrzymując preparat fagowy, który po przygotowaniu można stosować jako środek przeciwbakteryjny [12, 34].

Problemy w technologii preparatów fagowych

Spełnienie wymagań stawianych preparatom farmaceutycznym jest dużym wyzwaniem w przypadku bakteriofagów. Muszą być one dobrze tolerowane i bezpieczne dla pacjentów oraz powinny umożliwiać przechowywanie bakteriofagów z wystarczającą stabilnością [17].

Problematyczne są zanieczyszczenia preparatów fagowych, których źródłem mogą być składniki pożywki oraz produkty rozpadu bakterii. Najistotniejszym zanieczyszczeniem w przypadku preparatów otrzymywanych z wykorzystaniem bakterii Gram-ujemnych jest lipopolisacharyd (endotoksyna, pirogen), który jest immunostymulatorem. Jego podwyższony poziom w krwiobiegu jest powodem wielu patofizjologicznych reakcji [16]. Ograniczeniem w stosowaniu bakteriofagów może być wysoka specyfika bakteriofagów, a co za tym idzie niewielka liczba ich gospodarzy. Z tego powodu obserwowano niepowodzenia w selekcji fagów litycznych dla docelowych gatunków bakterii. Odnotowano słabą stabilność i/lub żywotność preparatów fagowych w przypadku gdy np. do niektórych preparatów fagowych dodawano preparaty rtęci lub środki utleniające lub gdy poddawano je obróbce cieplnej w celu zapewnienia sterylności. Wiele z tych zabiegów mogło inaktywować fagi, co powodowało nieskuteczność preparatów fagowych. Brak rozróżnienia między fagami litycznymi i lizogennymi może skutkować zastosowaniem fagów lizogennych, które są znacznie mniej skuteczne niż fagi lityczne. W celu rozwiązania powyższych problemów stosuje się wielowartościowe koktajle fagowe, które rozkładają większość szczepów czynnika etiologicznego. W celu otrzymania preparatów fagowych o wysokiej czystości należy zastosować chromatografię jonowymienną, wirowanie z dużą prędkością i inne nowoczesne techniki oczyszczania. Żywotność i miano fagów należy ustalić przed ich terapeutycznym użyciem. Uważnie należy wybierać fagi lityczne. Ma to również kluczowe znaczenie dla uniknięcia możliwego poziomego przenoszenia toksyny bakteryjnej oraz genów oporności na antybiotyki przez fagi lizogenne [29]. Konieczne jest opracowanie metod oczyszczania, warunków przechowywania, sterylizacji i stabilizacji preparatów fagowych [16].

Aspekty prawne leczenia bakteriofagami

Preparaty fagowe stosowane w leczeniu pacjentów objętych eksperymentem leczniczym nie są zarejestrowane przez Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych. Taka forma terapii dostępna jest obecnie wyłącznie w ramach terapii eksperymentalnej. Jej idea wynika z Deklaracji Helsinskiej, a jej zasady reguluje m.in. Ustawa o zawodzie lekarza i lekarza dentysty z dnia 05.12.1996r. W myśl obowiązujących przepisów prawnych, dopuszcza się stosowanie u pacjentów nowych lub tylko częściowo wypróbowanych metod leczniczych w celu osiągnięcia bezpośredniej korzyści dla zdrowia osoby leczonej, w sytuacji kiedy dotychczas stosowane metody medyczne nie były skuteczne lub jeśli ich skuteczność nie była wystarczająca. Postępowanie takie może być prowadzone w ramach eksperymentu leczniczego, na który musi wyrazić zgodę w drodze uchwały niezależna komisja bioetyczna [39].

Inne zastosowania bakteriofagów

Bakteriofagi są stosowane nie tylko w leczeniu chorób u ludzi, ale również zwierząt i roślin, a także w ochronie żywności [13, 24]. Fagi stosowane są już na skalę przemysłową jako środki antybakteryjne przy produkcji żywności np. do eliminacji Salmonelli czy też bakterii powodujących listeriozę [24, 39]. Rozwijane są również metody identyfikacji bakterii, wykorzystujące wysoką specyficzność fagów w wiązaniu się i infekowaniu określonych gatunków mikroorganizmów, np. test wykorzystujący infekcję fagową do wykrywania Staphyloccocus aureus opornego na metycylinę [16, 24].

Wnioski

Na skutek powszechnego, a także często nieracjonalnego stosowania antybiotyków, każdego roku rośnie liczba mikroorganizmów opornych na działanie tych leków. Liczba nowych środków przeciwbakteryjnych wprowadzanych obecnie na rynek jest niewielka, natomiast śmiertelność na skutek infekcji jest niepokojąco wysoka [18]. Poszukiwanie i rozwijanie alternatywnych do antybiotykoterapii metod zwalczania zakażeń bakteryjnych stało się koniecznością. Zyskująca coraz większe zainteresowanie fagoterapia wydaje się być alternatywą dla coraz mniej skutecznych antybiotyków.

Bakteriofagi są cennym i często jedynym skutecznym czynnikiem w infekcjach bakteryjnych. Są one dość bezpieczne. Działania niepożądane po ich zastosowaniu są raczej rzadkie i nie stanowią zagrożenia dla pacjenta, są przemijające i łatwe do opanowania. Można je stosować niezależnie od wieku. Bakteriofagi skutecznie kontrolują proces zakaźny, odbudowując siły odpornościowe organizmu. Są również skuteczne w leczeniu infekcji powikłanych przez zaburzenia immunologiczne. Bakteriofagi łatwo przenikają przez błony śluzowe do krwi i innych tkanek wywierając znaczący efekt terapeutyczny [32]. Zaletą terapii fagowej, w porównaniu z antybiotykoterapią, jest bardzo wąski zakres jej działania oraz zachowanie naturalnej flory bakteryjnej przewodu pokarmowego, bez konieczności dostarczania probiotyków [9].

Fagi są szczególnie przydatne w walce z bakteriami opornymi na wiele leków. Leczenie fagami może pomóc w zmniejszeniu częstotliwości potencjalnie śmiertelnych infekcji w środowisku szpitalnym, przy kosztach, które mogą być znacznie niższe niż w przypadku antybiotykoterapii. Terapia fagowa jest wciąż rozwijana, a preparaty fagowe są ulepszane i dostosowane do indywidualnych potrzeb pacjentów. Nowa wiedza, zdobywana przy każdym kolejnym badaniu, zwiększa zrozumienie czynników, które wpływają na bezpieczeństwo i skuteczność aplikacji bakteriofagowych w medycynie, weterynarii i przemyśle [17].

Fagoterapia jest fascynującą dziedziną nauki, wykorzystującą najstarsze i co najważniejsze naturalne mechanizmy regulacji populacji bakteryjnych w przyrodzie. W obliczu powszechnej antybiotykoodporności, jest jedną z najbardziej obiecujących strategii terapeutycznych, często jedyną możliwą dla ratowania życia pacjentów.

 

Literatura`

  1. How Phages Overcome the Challenges of Drug Resistant Bacteria in Clinical Infection. Moghadam M. T. , Amirmozafari N., Shariati A., Hallajzadeh M., Mirkalantar S., Khoshbayan A., Jazi F. M.; Infection and Drug Resistances 2020:13 45-61.
  2. Safety and Tolerability of Bacteriophage Therapy for Chronic Rhinosinusitis Due to Staphylococcus aureus; Ooi L.,  Drilling A.J.,  Morales S.,  Fong S.,  Moraitis S.,  Macias-Valle L.,  Vreugde S.,   Psaltis A. J.,  Wormald P. J.; JAMA Otolaryngol. Head Neck Surg. 2019 Aug.; 145(8): 723–729.
  3. Bacteriophages, phage endolysins and antimicrobial peptides – the possibilities for their common use to combat infections and in the design of new drugs. Mirski T., Mizak L., Nakonieczna A., Gryko R.; Annals of Agricultural and Environmental Medicine 2019, Vol 26, No 2, 203–209.
  4. Formation of therapeutic phage cocktail and endolysin to highly multi-drug resistant Acinetobacter baumannii: in vitro and in vivo study. Jasim HN, Hafidh RR, Abdulamir AS; Iran J Basic Med Sci, Vol. 21, No. 11, Nov 2018.
  5. Bakteriofagi – dobroczynne wirusy. Gibała A., Szaleniec J., Szaleniec M.; Wszechświat, t. 119, nr 7 ̶ 9/2018.
  6. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. LinM, Koskella B., Lin H. C; World J. Gastrointest. Pharmacol. Ther. 2017 Aug 6; 8 (3): 162–173.
  7. „Nowe” i „stare” antybiotyki – mechanizmy działania i strategie poszukiwania leków przeciwbakteryjnych. Kozińska A., Sitkiewicz I.; Kosmos 2017 vol. 66, 1, 109–124.
  8. Wybrane aspekty zwalczania bakterii lekoopornych. Lewańska M., Olszewska D., Godela A., Myga- Nowak M., Kuberska M. Environ. Biotechnol. , 19, 2016, strony 79-85.
  9. Alternatywy dla antybiotykoterapii – peptydy przeciwdrobnoustrojowe i bakteriofagi. Żelechowska P., Agier J., Kozłowska E., Brzezińska-Błaszczyk E.; Przegląd Lekarski 2016/73/5.
  10. Innowacyjne metody leczenia – terapeutyczne zastosowanie bakteriofagów. Ochońska D., Brzychczy-Włoch M., Bulanda M.; Zakażenia, 2016, 1.
  11. Wykorzystanie bakteriofagów w łańcuchu żywnościowym. Kowalska M., Sokołowska B Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2016, 4 (107), 26 – 36.
  12. Fantastyczny fach fagów. – wywiad: z prof. Andrzejem Górskim rozmawiała Agnieszka Kloch Magazyn Polskiej Akademii Nauk; 3/47/2016, 36-39.
  13. Biologia molekularna bakterii. Baj J., Markiewicz Z.; 2015, PWN wyd. 2 str. 354-402.
  14. Liza komórek bakteryjnych w procesie uwalniania bakteriofagów – kanoniczne i nowo poznane mechanizmy. Woźnica W. M., Bigos J., Łobocka M. B.; Postepy Hig Med Dosw (online), 2015; 69: 114-126.
  15. Poszukiwanie nowych opcji terapeutycznych w zwalczaniu opornych zakażeń bakteryjnych. Głabski T., Rusek-Atkinson D., Mikołajczyk J.; Terapia i leki, 2014, 70, 7, str. 385-394.
  16. Bakteriofagi – nanocząsteczki o szerokich zastosowaniach. Szermer-Olearnik B. Boratyński J.; Chemik, 2014, 68, 9, str. 761-765.
  17. Review Facing Antibiotic Resistance: Staphylococcus aureus Phages as a Medical Tool. Kaźmierczak Z., Górski A., Dąbrowska K.; Viruses 2014, 6, 2551-2570.
  18. Naturalne peptydy przeciwdrobnoustrojowe w zastosowaniach biomedycznych. Janiszewska J.; Polimery 2014, 59, nr 10.
  19. Professor Dr. Richard Bruynoghe. A 1951 Overview of his bacteriophage research spanning three decades. Lavigne R,  Robben J.; Bacteriophage 2012, 2 (1), 1-4.
  20. Występowanie tetracyklin w tkankach i produktach pochodzenia zwierzęcego – przyczyny i skutki. Gajda A., Posyniak A., Żmudzki J., Różańska H.; Med. Wet. 2012, 68 (11).
  21. Funkcje białek bakteriofagowych. Brzozowska A., Bazan E., Gamian J.; Postępy Hig. Med. Dośw. (online) 2011, 65, str. 167-176.
  22. Nowy stary sposób na bakterie. Dr Wojtasik A.; Przemysł Farmaceutyczny 2011, 4.
  23. Bakteriofag T4: molekularne aspekty infekcji komórki bakteryjnej, rola białek kapsydowych. Figura G., Budynek P., Dąbrowska K.; Postepy Hig. Med. Dosw. (online), 2010; 64: 251-261.
  24. Bakteriofagi i fagoterapia. Gryko R., Parasion S., Mizak L.; Medycyna Wet. 2010, 66 (4).
  25. Phage Therapy Pharmacology. Abedon S.T., Abedon C.T;. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11, 28-47.
  26. Wybrane mechanizmy oporności bakterii na chemioterapeutyki. Jabłoński A., Zębek S. , Mokrzycka A.; Medycyna Wet. 2010, 66 (7), 449-452.
  27. Phage therapy of staphylococcal infections (including MRSA) may be less expensive than antibiotic treatment. Międzybrodzki R. Fortuna W., Weber-Dąbrowska B., Górski A.; Postępy Hig. Med. Dośw. 2007; 61: 461-4265.
  28. Successful eradication of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) intestinal carrier status in a healthcare worker – case report. Leszczyński P., Weber-Dąbrowska B., Kohutnicka M., Luczak M., Górecki A.; Folia Microbiol. 2006; 51: 236-238.
  29. Bacteriophage Therapy. Sulakvelidze A., Alavidze Z., Morris J. G., Jr.; Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, Mar., 3, Tom 45, str. 649-659.
  30. Biochemia Stryer L.; 1999 Wydawnictwo Naukowe PWN, wyd. 4, str. 844.
  31. Biologia. Salomon E. P., Berg L. R., Martin D. W., Ville C. A.,; 1996, Multico Oficyna Wydawnicza, wyd.3, str. 510-513.
  32. Results Of Bacteriophage Treatment Of Suppurative Bacterial Infections I. General evaluation of the results. Slopek S., Durlakowa I., Weber-Dabrowska B., Kucharewicz-Krukowska A., Dabrowski M., Bisikiewicz R.; Archivum Immunologiae Et Therapiae Experimentalis 1983, 31, 267-291.
  33. Comparison of several methods for preserving bacteriophages. Clark W. Appl. Microbiol. 1962, 10, 466–471.
  34. https://wyborcza.pl/TylkoZdrowie/1,137474,19666788,fagi-zamiast-antybiotyku-na-niegojace-sie-rany-i-ciezkie-zakazenia.html (dostęp 17.08.2020).
  35. https://biotechnologia.pl/biotechnologia/metody-sekwencjonowania-powtorka-przed- sesja,14136 (dostęp 12.08.2020).
  36. https://www.oxfordreference.com/view/10.1093/oi/authority.20110803095931480 (dostęp 11.08.2020).
  37. http://knbmol.pl/knbm-mature-up/to-lyse-or-not-to-lyse-that-is-the-question (dostęp 12.07.2020).
  38. http://antybiotyki.edu.pl/wp-content/uploads/Biuletyn/biuletyn -npoa-2012_3.pdf (dostęp 11.07.2020);  MDR, XDR, PDR – jednolite, międzynarodowe definicje nabytej oporności drobnoustrojów na antybiotyki; Żabicka D., Literacka E., Bojarska K.; Aktualności Narodowego Programu Ochrony Antybiotyków Nr 3/2012.
  39. http://www.iitd.pan.wroc.pl (dostęp 20.06.2020) – Strona internetowa Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu.

 

Autorka: mgr farm. Magdalena Głuszak-Ayeligeya — praca specjalizacyjna

REKLAMA
REKLAMA

Warning: Invalid argument supplied for foreach() in /home/klient.dhosting.pl/farmacja/aptekaszpitalna.pl/public_html/wp-content/plugins/famacja-net-klient/klient.php on line 459

Jak oceniasz artykuł?

Twoja ocena: Jeszcze nie oceniłeś/aś artykułu

Udostępnij tekst w mediach społecznościowych

0 komentarzy - napisz pierwszy Komentujesz jako gość [ lub zarejestruj]

Szanowni Państwo,

Farmacja.net sp. z o. o. przetwarza Twoje dane osobowe zbierane w Internecie, w tym informacje zapisywane w plikach cookies, w celu personalizacji treści oraz reklamy, udostępniania funkcji mediów społecznościowych oraz analizowania ruchu w Internecie.

Kliknij „Zatwierdź i przejdź do serwisu”, aby wyrazić zgodę na korzystanie z technologii takich jak cookies i na przetwarzanie przez farmacja.net sp. z o .o. , Zaufanych Partnerów Twoich danych osobowych zbieranych w Internecie, takich jak adresy IP i identyfikatory plików cookie, w celach marketingowych (w tym do zautomatyzowanego dopasowania reklam do Twoich zainteresowań i mierzenia ich skuteczności) i pozostałych, szczegółowo opisanych w ustawieniach zaawansowanych.

Zgoda jest dobrowolna i możesz ją w dowolnym momencie wycofać w ustawieniach zaawansowanych.

Ponadto masz prawo żądania dostępu, sprostowania, usunięcia lub ograniczenia przetwarzania danych. W polityce prywatności znajdziesz informacje jak zakomunikować nam Twoją wolę skorzystania z tych praw.

Szczegółowe informacje na temat przetwarzania Twoich danych znajdują się w polityce prywatności.

Instalowanie cookies itp. na Twoich urządzeniach i dostęp do tych plików.

Na naszych stronach internetowych używamy technologii, takich jak pliki cookie i podobne służących do zbierania i przetwarzania danych eksploatacyjnych w celu personalizowania udostępnianych treści i reklam oraza analizowania ruchu na naszych stronach. Te pliki cookie pomagają poprawić jakość treści reklamowych na stronach. Dzięki tym technologiom możemy zapiewnić Ci lepszą obsługę poprzez serwowanie reklam lepiej dopasowanych do Twoich preferencji.

Nasi zaufani partnerzy to:

Facebook Ireland Limited – prowadzenie kampani remarektingowych i mierzenie ich efektywności – Irlandia (EOG)

Google Ireland Limited (Google Adwords, DoubleClick Ad Exchange, DoubleClick for Publishers Small Business) – zarządzanie kampaniami reklamowymi, ich analiza i pomiary ruchu na stronach Serwisu – Irlandia (EOG)

Google Incorporated (Google Analytics, Google Cloud Platform, GSuit, Google Optimize, Google Tag Manager, Google Data Studio) – obsługa kampanii reklamowych, analizowanie ruchu na stronach Serwisu i obsługa poczty firmowej, analiza sposobu korzystania z Serwisu przez Użytkownika – USA (poza EOG)

Comvision sp. z o. o. – wysyłanie informacji marketingowych dotyczących Serwisu – Polska (EOG)

Benhauer sp. z o.o. – prowadzenie kampanii remarketingowych i mierzenie ich efektywności, e-mail Marketing – Polska (EOG)

Oświadczenie

Dostęp do zawartości serwisu aptekaszpitalna.pl jest możliwy dla osób uprawnionych do wystawiania recept lub osób prowadzących obrót produktami leczniczymi.

Ustawienia zaawansowane Wstecz
logo